A doménzáródás szerepe az aktív centrum kialakításában: irányított mutagenezis vizsgálatok a 3-foszfogicerát kinázon = Role of domain closure in formation of the active site geometry by site-directed mutagenesis of 3-phosphogycerate kinase

Pollnerné Flachner, Beáta (2008) A doménzáródás szerepe az aktív centrum kialakításában: irányított mutagenezis vizsgálatok a 3-foszfogicerát kinázon = Role of domain closure in formation of the active site geometry by site-directed mutagenesis of 3-phosphogycerate kinase. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 48578_ZJ1.pdf Download (1MB)

Abstract

A két doménból felépülő 3-foszfoglicerát kináz (PGK) doménzáródással működő enzim. Nem ismert, hogy mi a doménzáródás alapvető mozgató rugója, hogy miért szükséges mindkét szubsztrát egyidejű kötődése, és ez milyen molekuláris mechanizmussal indítja el a doménzáródást. Biofizikai módszerekkel és az ismert kristályszerkezetek összehasonlításával megállapítottuk, hogy miért stabilizálja bármelyik szubsztrát kötődése a másik domént és miért csak a terner komplexek esetében jön létre a zárt konformáció. A szubsztrátok együttes kötődése működteti a ?L-ben elhelyezkedő kettős molekuláris kapcsolót. A konformációváltozások közvetítésében résztvevő interdomén-régió és a MgATP kötésében résztvevő konzervatív oldalláncokat irányított mutagenezissel Ala-ra cseréltem és kinetikai ill. biofizikai vizsgálatoknak vetettem alá. Megállapításaim: 1) Az R38 mellett a K215 is katalitikus oldallánc, mely a MgATP ?-foszfátjával együtt mozdul el és azt a megfelelő helyzetbe pozícionálja a katalízis és a doménzáródás során. 2) Nukleotid szubsztrát által kiváltott konformációs hatás molekulán belüli terjedésének mechanizmusában a K219 mellett az N336 és a E343 játszik kulcs szerepet. 3) A bL redő konzervatív S392, T393, valamint a környező F165, E192 és F196 oldalláncoknak is fontos szerepe van a 3-PG indította konformációváltozás továbbításában, azonban egyetlen vizsgált oldallánc sem felelős egyedül a molekuláris csukló működtetéséért, hanem ezek együttes kapcsolatrendszere szabályozza azt. | 3-Phosphoglycerate kinase (PGK) is a two-domain hinge-bending enzyme with a well-structured interdomain region. The mechanism of domain?domain interaction, its regulation by substrate binding, the requirement of both substrates for binding and the mechanism of substrate assisted domain closure is not yet fully understood. Molecular graphical analysis of the known crystal structures and biophysical investigations have shown, that binding of either substrate stabilizes the other domain and binding of both substrates is essential for domain closure and also directs the operation of a double molecular switch at the ?L. Site directed mutations were designed at the MgATP binding site and the interdomain region: 10 conserved residues were changed to Ala and were investigated in functional and biophysical measurements. Main findings are: 1) K215 is a catalytic residue, like R38. This interacts with the g-phosphate of MgATP and assists in its proper positioning for the catalysis during domain closure. 2) The nucleotide site residues (K219, N336, E343) have essential role in the transmission of the nucleotide induced effect towards the main hinge. 3) S392 and T393 residues in bL and the surrounding F165, E192 and F196 are involved in transmission of the effects of 3-PG from one domain to the other. Neither of these side-chains is responsible alone for functioning of the molecular hinge at the ?L, rather the cumulative effects of their multiple interactions operate in the hinge region.

Actions (login required)

Edit Item