MAP kináz jelátvitel funkcionális vizsgálat mitokondriumban = Functional studies on mitochondrial MAP kinase signalling

Bánhegyi, Gábor and Horváth, V. Gábor and Mészáros, Tamás and Szarka, András (2011) MAP kináz jelátvitel funkcionális vizsgálat mitokondriumban = Functional studies on mitochondrial MAP kinase signalling. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 69187_ZJ1.pdf Download (291kB) | Preview

Abstract

Munkánk során a növényekre specifikus, kevésbé vizsgált, D típusú MAPKok családjának egyik tagját az AtMPK9-t tanulmányoztuk. Élesztő kettős-hibrid rendszerrel a kalmodulint, mint lehetséges AtMPK9 fehérje partnert azonosítottuk, majd a kölcsönhatást in vitro transzlációval előállított fehérjékkel többféle megközelítéssel igazoltuk. Az AtMPK9 poszttranszlációs módosításokon keresztül történő szabályozása korábban ismeretlen volt. A pályázat keretében tömegspektrometriás vizsgálatokkal és in vitro mutagenezissel előállított AtMPK9 variánsokkal bizonyítottuk, hogy az aktiválásért felelős T hurok régióban elhelyezkedő TDY aminosav triplet treoninjának és tirozinjának foszforilálása nélkül a kináz nem rendelkezik aktivitással. A tömegspektrometriás adatok alapján az is nyilvánvaló vált, hogy az AtMPK9 kináz doménjét követő C-terminális doménben további négy aminosav foszforilálódik. Vizsgálataink szerint az összes általunk azonosított foszforiláció autofoszforiláció eredménye. Feltételezésünk szerint a kináz autofoszforilációs aktivitásának szabályozásában a kölcsönható partnerként azonosított kalmodulin kaphat szerepet. Az AtMPK9 in planta funkcióját protoplaszt tranziens expresszióval és null-mutáns növényekkel tanulmányoztuk. Vizsgálataink alapján a fehérje kináz abiotikus stresszel aktiválható, azonban ennek ellenére a null-mutáns növények fenotípusa még stressz körülmények között sem tér el a vadtípusétól, így az AtMPK9 valószínűsíthetően funkcionálisan redudáns kináz. | The project aimed at studying AtMPK9, a member of plant specific, D type mitogen activated protein kinase (MAPK). We identified calmodulin as its putative protein interacting partner by yeast two-hybrid assay. In order to evaluate this result, AtMPK9 and calmodulin were produced by in vitro translation and the interaction was confirmed by pull-down assays and surface plasmone resonance analysis. The kinase activity regulation of AtMPK9 was unknown previously. We demonstrated by mass spectrometry and in vitro mutagenesis studies that phosphorylation of threonine and tyrosine of TDY amino acid triad of T loop is inevitable for kinase activity. Further mass spectrometry analysis revealed another four phosphorylated amino acids in the C-terminal domain of AtMPK9. According to our in vitro translation based data, all the identified phosphorylations are caused by autophosphorylation. We hypothesize that the interacting partner calmodulin regulates the autophosphorylation activity of kinase. The in planta function of the protein kinase was studied by protoplast transient overexpression and application of AtMPK9 knock-out plants. Although the kinase activity of AtMPK9 was inducible by abiotic stress, the knock-out plants did not show any difference in phenotype, not even in stress conditions. These data imply that AtMPK9 is a functionally redundant protein kinase.

Actions (login required)

Edit Item