Konzorcium, fő p.: Az ErbB fehérjék asszociációinak összefüggése a receptor orientált daganatterápiával szembeni rezisztenciával = Consortional main: Correlation between the association state of ErbB proteins and resistance to receptor-oriented cancer therapy

Nagy, Péter and Szöllősi, János (2012) Konzorcium, fő p.: Az ErbB fehérjék asszociációinak összefüggése a receptor orientált daganatterápiával szembeni rezisztenciával = Consortional main: Correlation between the association state of ErbB proteins and resistance to receptor-oriented cancer therapy. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 72677_ZJ1.pdf Download (412kB) | Preview

Abstract

A trastuzumab rezisztencia és a hialuronsav expresszió közötti összefüggés igazolásához kifejlesztettünk egy olyan módszert, amely a sejtmembránban meghatározza az ErbB2-re normalizált trastuzumab mennyiségét és a környező hialuronsav denzitást. Humán emlőtumor mintákon igazoltuk, hogy a trastuzumab kötődése fordítottan arányos a hialuronsav pericelluláris mennyiségével. A szövetek hialuronidáz emésztése fokozta a trastuzumab kötődését, ami alátámasztja a maszkírozás jelenlétét. Az elisidepsinről megállapítottuk, hogy a GPI-kötött fehérjék internalizációját váltja ki,és fokozza a sejtmembrán fluiditását és csökkenti a lipid molekulák hidratációját. Ezek alapján a gyógyszer elsődleges támadáspontja a membrán lipid tutaj komponense. Kifejlesztettük a FRET-érzékenyített akceptor kiégetési technikát, amellyel lehetséges két fehérje egymással asszociáló arányának és a heteroklaszterek sztöchiometriájának meghatározása. Megállapítottuk, hogy stimulálatlan SKBR-3 sejtekben ErbB1 és ErbB2 aránya 1:1,5 volt a heteroklaszterekben, és ezt az EGF kezelés 1:4-re növelte. „Number and brightness” méréseink alapján az ErbB1 stimulálatlan sejtekben elsősorban monomer állapotban van fiziológiás expressziós szintek esetében. EGF stimulációt követően, ill. jelentős overexpresszió jelenlétében EGF dimerek és a klatrin burkolt gödrökben ennél nagyobb klaszterek is vannak. Ezzel szemben az ErbB2 stimulálatlan sejteken nagyméretű klasztereket alkot, melyek mérete EGF stimuláció hatására csökken. | In order to prove the relationship between trastuzumab resistance and hyaluronan expression we developed a method for determining the ErbB2-normalized binding of trastuzumab in the membrane and the hyaluronan density in the surrounding tissue. We showed on human breast cancer samples that trastuzumab binding is inversely related to pericellular hyaluronan density. Hyaluronidase digestion resulted in enhanced trastuzumab binding implying masking of ErbB2. We showed that elisidepsin induces the internalization of GPI-anchored proteins, increases the fluidity of the cell membrane and decreases the hydration of lipid molecules. Based on these findings the primary target of elisidepsin is the lipid raft in the cell membrane. We developed a method (FRET-sensitized acceptor bleaching) capable of reporting the fraction of proteins associating with each other and of determining the stoichiometry of heteroclusters. We showed that the ratio of ErbB1 and ErbB2 in their heteroclusters was 1:1.5 in quiescent SKBR-3 cells which was increased to 1:4 by EGF treatment. Using number&brightness analysis we demonstrated that ErbB1 is present primarily as monomers in unstimulated cells at physiological expression levels. After EGF stimulation and in the presence of pathologic overexpression constitutive dimers and larger cluster are also present in clathrin-coated pits. To the contrary, ErbB2 forms large-scale associations in quiescent cells which are disassembled upon EGF stimulation.

Actions (login required)

Edit Item