REAL

Dezoxinukleozid kinázok szerepe a DNS repair és az apoptózis folyamatában = The role of deoxynucleoside kinases in DNA repair and apoptosis

Szpaszokukockaja, Tatjana and Keszler, Gergely and Sasvári, Mária and Staub, Mária (2009) Dezoxinukleozid kinázok szerepe a DNS repair és az apoptózis folyamatában = The role of deoxynucleoside kinases in DNA repair and apoptosis. Project Report. OTKA.

[img]
Preview
PDF
46730_ZJ1.pdf

Download (103Kb)

Abstract

A genotoxikus anyagok és a besugárzás DNS-károsodást váltanak ki, amelynek szenzora a p53 tumor-szuppresszor fehérje. A kezelések hatására a limfocitákon és a vad típusú p53-at expresszáló DG-75 sejtvonalon többszörös dezoxicitidin-kináz (dCK) aktiválódást észleltünk, ellentétben a p53-at nem expresszáló BL-41 és Ramos sejtekkel. A pifithrin-alfával és a Ca2+-kelátor BAPTA-AM-mel a dCK-aktiválódás felfüggeszthető. Az eredmények azt valószínűsítik, hogy a p53 és a Ca2+ lényeges szerepet játszik a dCK aktiválódásban. Az aktivált enzim stabilabb, immunreaktivitása fokozott a kontroll enziméhez képest. Limitált tripszinolízis segítségével bebizonyítottunk, hogy a dCK aktiválása közben konformáció-változás történik. Az aktivált dCK foszfoprotein-foszfatáz emésztésével, a tisztított dCK kétdimenziós elektroforézisével, valamint affinitás-kromatográfiával elsőként mutattuk ki, hogy a dezoxicitidin-kináz fehérjének legalább 30%-a foszforilált. Azonban a foszforilációs helyek azonosítása tömeg-spektroszkópiai analízissel nem sikerült, valószínűleg az endogén dCK kis mennyisége és az általunk használt tömegspektroszkópiás módszer nem eléggé érzékeny volta miatt. A dAdo is hatékonyan stimulálta a dCK-t, párhuzamosan a sejtek kaszpáz-3-aktivitása és a dATP-pool is szignifikánsan (150-170%) emelkedett, miközben a pirimidin-poolok 30-50%-kal csökkentek. Az eredmények azt bizonyítják, hogy a dCK aktiválódásának fontos szerepe lehet a dAdo-mediálta citotoxicitásban. | Both genotoxic agents and irradiation cause DNA damage that activates the p53 tumour suppressor protein. Deoxycytidine kinase (dCK) activity was stimulated several fold in irradiated lymphocytes and in DG-75 cells expressing wild-type p53, but not in p53-/- BL-41 and Ramos cells. Enhancement of dCK activity can be totally released with p53 inhibitors or with the calcium chelator BAPTA-AM. These results suggest that both p53 and Ca2+ play an important role in the activation of dCK.The activated enzyme is more stable and its native immunoreactivity is increased as compared to the control species. Using limited tripsinolysis, we have proven that dCK undergoes a conformational change during activation. We also demonstrated by several assays (phosphoproteine phosphatase digestion, two-dimensional electrophoresis, affinity chromatography) that 30% of the cellular dCK pool is phosphorylated. However, we failed to identify the phosphorylated amino acid residues in the dCK sequence, probably due to the too low amounts of endogenous dCK in cells, and the mass spectrometry method we had used might not have been sensitive enough. dAdo effectively stimulates dCK, and we could observe parallel activation of caspase 3 and a simultaneous 150-170% increase of the dATP pool, paralleled by 30-50% decrease of pyrimidine pools. These results underline the importance of dCK activation in the mechanism of dAdo-mediated cytotoxicity.

Item Type: Monograph (Project Report)
Uncontrolled Keywords: Elméleti Orvostudomány
Subjects: R Medicine / orvostudomány > R1 Medicine (General) / orvostudomány általában
Depositing User: Mr. Andras Holl
Date Deposited: 08 May 2009 11:00
Last Modified: 30 Nov 2010 17:26
URI: http://real.mtak.hu/id/eprint/1555

Actions (login required)

View Item View Item