Extracelluláris fehérje gének működésének és regulációjának tanulmányozása = Study of regulation and expression of extracellular matrix proteins encoding genes

Kénesi, Erzsébet (2009) Extracelluláris fehérje gének működésének és regulációjának tanulmányozása = Study of regulation and expression of extracellular matrix proteins encoding genes. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 50006_ZJ1.pdf Download (421kB)

Abstract

Tranziens expressziós kísérletekkel, deléciós klónokkal kimutattam, hogy a Dpe1 jelenléte szükséges a magas szintű porcspecifikus expresszióhoz. A Dpe1 deléciója a hosszú promoterből csökkenti a porcspecifikus riporter gén aktivitást, de több kópiás jelenléte a rövid promoter szakasz előtt nem okoz aktivitás növekedést a Dpe1-hez hasonlóan, sőt a Dpe1 elemmel kombinálva gátolja ennek működését. Deléciós klónok tranziens expressziós tesztelése rámutatott arra is hogy az IKAROS kötőhely is fontos szerepet tölt be az expresszió szabályozásban. Előállítottam és tranziens expresszióval teszteltem olyan AC8Luc klónokat, melyekben a Pe1 (Sox kötőhely), Ine (Sox-kötőhely) és az SI (NFI-kötőhely) elemek rendre el lettek mutálva. Ezen elemek mutációja alapszintre csökkentette a hosszú promoter által meghajtott riporter gén porcspecifikus aktivitását is. Kimutattam, hogy a rövid promoter hatását heterológ enhancer elemek (COL2A1 48bp-enhancere) is képesek fokozni valószínű a Sox kötés miatt, ezáltal még jobban alátámasztottam azt az elképzelésünket, hogy a távoli enhancer elemek Sox fehérjék segítségével hatnak a rövid promoter aktivitására. EMSA kísérletekkel igazoltam rekombináns Sox9 fehérje kötését a Dpe1 és Dpe2 elemekhez. EMSA és supershift kísérletekkel alátámasztottam a HMGB1 kötését az Ine elemhez Chondrocita, illetve chondroszarkóma sejtmagi kivonatokból biotinilált kétszálú LIE oligonukleotidok és MALDI tömegspektroszkópiával segítségével kimutattuk az NFI -A és NFI-C kötését. | Multiple copies of the Dpe1 element highly increased the FO15Luc activity in CEC cultures. Using transient expression assays and deletion mutants it was shown that the presence of Dpe1 element is necessary for the high-level chondrocyte-specific gene activity. Deletion of the Dpe2 element decreased the reporter gene activity in transient expression studies. Multiple copies of Dpe2 do not have any effect on the chondrocyte specific FO15Luc activity. Moreover when combined with Dpe1 element, Dpe2 attenuated the enhancer effect of the Dpe1 element depending on the mode of combination. Using deletion mutants it was shown in transient expression assays that the IKAROS binding DNA element is also important for the high-level chondrocyte-specific activity. Pe1, Ine and SI mutants of the AC8Luc construct were made and tested in transient expression assays. Data show that mutation of any of these elements decreased the chondrocyte specific activity of the AC8Luc construct at the level of the FO15Luc construct. The heterologous Col2a1 enhancer element (Sox-binding sites), used in multiple copies elevates the chondrocyte specific activity of the short promoter more above the levels of the AC8Luc activity. EMSA experiments demonstrated the binding of recombinant Sox proteins to Dpe1 and Dpe2. Using biotinylated double-stranded oligonucleotides bearing the LIE sequence, and CEC nuclear extracts, was demonstrated with MALDI mass spectroscopy the binding of NFI-A, and NFI-C to the LIE element.

Actions (login required)

Edit Item