A XIII-as véralvadási faktor A és B alegységének kapcsolódásáért felelős struktúrális elemek azonosítása a B alegységben = Identification of the binding domain(s) involved in the binding with FXIII-A on FXIII-B

Balogh, István (2009) A XIII-as véralvadási faktor A és B alegységének kapcsolódásáért felelős struktúrális elemek azonosítása a B alegységben = Identification of the binding domain(s) involved in the binding with FXIII-A on FXIII-B. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 60643_ZJ1.pdf Download (533kB)

Abstract

1. rFXIII-B. Máj cDNS könyvtárból klónoztam a teljes hosszúságú FXIII-B cDNS-t és előállítottam a 2, 4, 6, 8 Sushi domént tartalmazó mutánsokat. Az optimalizált expressziós rendszer a COS-7-DEAE-dextrán kombináció volt. A médiumból a rFXIII-t és mutánsait Ni-kromatográfiával részlegesen tisztítottam nem denaturáló körülmények között. A fehérjékben a diszulfid hidak kialakultak és a rekombinánsok molekulasúlya jól korrelált a várttal. A stabilitás vizsgálat során degradáció nem volt kimutatható. 2. rFXIII-A. A FXIII-A cDNS-t klónoztam és pET vektorba inzertáltam. A benne levő Shine-Dalgarno szekvenciát megszüntettem. Az expressziós kísérletek nem sikerültek. Ezután maltóz-kötő fehérjével fúzióban próbáltam meg a rFXIII-A-t expresszálni, de sem peri- sem citoplazmatikus esetben nem sikerült a rFXIII-A előállítása. Ezután a rFXIII-A esetében is pcDNA emslő rendszert használtam az expresszióra. Ni-oszlopon a sejtlizátumból történő tisztítás után a rFXIII-A kimutatható volt. 3. Az alegységek kötődésének vizsgálata. A mikrolemezre rögzített rFXIII-A-hoz hozzáadva a rFXIII-B-t és deléciós mutánsait, minden esetben kaptam a kötődésre utaló jelet, mely a lekötött rFXIII-A mennyiségének függvénye volt. Fordított esetben is hasonló eredményt kaptam, azaz a lerögzített rFXIII-B és deléciós mutánsai a rFXIII-A-t kötik. Ez a megfigyelés még további megerősítést igényel, de az eredmények arra utalnak, hogy a FXIII-B N-terminálisa vesz részt a FXIII-A kötésben. | 1. rFXIII-B. The cDNA of FXIII-B was cloned from liver cDNA library and the deletion mutants containing 2, 4, 6 and 8 Sushi domains were generated. The optimized expression system used COS-7 cells and DEAE-dextran for transfection. For partial purification of the recombinants Ni-chromatography was used under mild conditions. Disulphide bridges were formed and the molecular weight of the recombinants correlated well with the calculated ones. No degradation was observed after prolonged storage period at 4°C. 2. rFXIII-A. The cDNA of FXIII-A was cloned and inserted into pET vector. Although the Shine-Dalgarno sequence was abolished, no rFXIII-A could be detected. After subloning into maltose-binding fusion system, rFXIII-A production was unsuccessful both in the periplasm and in the cytoplasm. Final attempt was to clone cDNA into pcDNA vector and express it in mammalian cell line. rFXIII-A could be detected from the cell lysate after partial purification on Ni-column. 3. Testing the binding of the subunits. When rFXIII-A was coated into the microplate and the rFXIII-B and its mutants were added, rFXIII-B-specific signal could be detected, which was proportionate to the amount of coated rFXIII-A. The reversed setting, where rFXIII-B and its mutants were coated yielded similar results. These observations, though preliminary, suggest that the N-terminal region of FXIII-B is responsible for the binding of FXIII-A.

Actions (login required)

Edit Item