Az első U-DNS nukleáz szerkezeti és funkcionális jellemzése. = Structural and functional characterisation of the first U-DNA nuclease

Beke, Angéla (2009) Az első U-DNS nukleáz szerkezeti és funkcionális jellemzése. = Structural and functional characterisation of the first U-DNA nuclease. Project Report. OTKA.

PDF 74200_ZJ1.pdf Download (2MB)

Abstract

A projekt az újszerű uracil-DNS nukleáz (UDE) részletes szerkezeti/funkcionális jellemzését célozta. Mivel az aktivitásmérést oligonukleotid szubsztrátra eddig nem sikerült adaptálni, módosítottuk a tervezett megközelítéseket. A tervezett nagyfelbontású gélelektroforetikus eljárást beállítottam, mely megfelelő méretű, szekvenciájú szubsztrát megtalálása, ill. az UDE megfelelő kezelése után alkalmas lesz az aktivitás részletes jellemzésére (hasadó kötések azonosítása, kovalens komplex létrehozása az aktív oldalláncok azonosítása, ill. eredményes kristályosítás végett). Ezért a projektben finomítottam az UDE tisztítási eljárását, kimutattam, hogy a "szennyező" nukleinsav RNS, főként az UDE mRNS-e (készülő kézirat). Majd kidolgoztam gélshift, footprint és limitált emésztési technikákat jellemezendő az oligonukleotidokkal (U-, T-DNS, RNS) kialakuló komplexeket, segítendő a megfelelő oligonukleotid szubsztrát azonosítását. Elvégeztük az UDE doménanalízisét, az 1A és 1B fragmens szerkezetmodellezését, leírtunk egy fiziológiásan releváns fragmenst (kézirat rev. alatt). Új antitestet fejlesztettünk az immáron nukleinsav-mentes UDE ellen, mely lehetővé tette egy új izoforma azonosítását, ill. immunoprecipitálását is. Jellemeztem a két, izoforma-specifikus antitest domináns epitópjait, ill. az új izoforma fejlődésbeli expressziós mintázatát (készülő kézirat). Az UDE csendesítése siRNS-sel D. melanogasterben megerősítette a feltételezett fejlődésbiológiai szerepét (beküldött kézirat). | In the project, we aimed at detailed structural/functional characterisation of the novel uracil-DNA nuclease (UDE). As the activity assay has not yet been adapted successfully for oligonucleotide substrate, our original approaches were modified. The planned electrophoretic assay with high-resolution was set up. This would allow in-depth characterisation of UDE activity (identification of scissile bonds, preparation of covalent complex to use for crystallisation and determination of active residues), if substrate of appropriate size and sequence will be found, or UDE will be handled in appropriate manner. Therefore, I refined the purification protocol of His-UDE, identified the contaminating nucleic acid as RNA(s), mostly including UDE mRNA (MS is under preparation). Gelshift, footprint and limited proteolytic assays were set up to describe complex formation (with U-, T-DNA, RNA) to help finding of appropriate oligonucleotide substrate. Domain analysis of UDE was performed, the structure of 1A and 1B fragments were modelled, and a physiologically relevant truncation (cf. T. castaneum) was described (MS is under revision). A new antiserum was developed against RNA-free UDE resulting in identification of a new isoform and its altered developmental expression pattern. Dominant epitopes of the two, isoform-specific antisera were described (MS is under preparation). The putative developmental role of UDE was confirmed in UDE-silenced Drosophila strain (MS is submitted).

Actions (login required)

Edit Item