Retrovirális proteinázok vizsgálata a rezisztencia kialakulásának megértéséhez, és felhasználásuk biológiai folyamatok szabályozására = Study of retroviral proteinases to understand development of resistance and their use in regulation of biological processes

Tőzsér, József and Bagossi, Péter and Boross, Péter and Miklóssy, Gabriella and Sperka, Tamás (2007) Retrovirális proteinázok vizsgálata a rezisztencia kialakulásának megértéséhez, és felhasználásuk biológiai folyamatok szabályozására = Study of retroviral proteinases to understand development of resistance and their use in regulation of biological processes. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 43482_ZJ1.pdf Download (129kB)

Abstract

Számos, gyógyszerrezisztenciában megjelenő mutációt tartalmazó HIV-1 proteináz specificitását, gátolhatósági profilját és dimerstabilitását jellemeztük. A gátolhatósági profilok elkészítéséhez nagykapacitású floreszcens mérési módszert dolgoztunk ki. Eredményeink arra utaltak, hogy a mutánsok gátolhatóságát jelentősen befolyásolta a ligandok konformációs flexibilitása, továbbá az enzim egyik régiója képes volt mutációktól függetlenül a ligandhoz illeszkedni. Cefalosporin származékokat tartalmazó vegyületkönyvtár szűrésével különleges, unkompetitív mechanizmusú HIV-1 proteináz inhibitorokat azonosítottunk. A HIV-1 fertőzés korai szakaszában szubsztrátként valószínűsített nukleokapszid fehérje hasításával kapcsolatban szubsztrát-mutagenezis és kinetikai vizsgálatokat végeztünk és a mutációkat a HIV vírusba bejuttatva korrelációt tapasztaltunk a fertőzőképesség és a nukleokapszid fehérje proteolitikus érzékenysége között. Különböző retrovírusok természetes hasítási helyeit reprezentáló oligopeptidekkel összehasonlítottuk retrovirális proteinázok specificitását, mely alapján a HTLV-1 proteáz szubsztrátspecificitása meglehetősen szűknek bizonyult. Egy HIV-1 természetes hasítási helyet reprezentáló oligopeptid sorozattal végzett korábbi szubsztrátspecificitási vizsgálatainkat részben kiegészítettük úgy, hogy az adatsor már 11 retrovirális proteáz adatait tartalmazza. Egy alhely feltérképezésével kapott eredményeink jól korreláltak a retrovírusok filogenetikai analízisével. | Specificity, dimer stability and inhibition profile was determined for several HIV-1 protease mutants harboring mutations occurring in drug resistance. To perform the inhibition profiling, a new, high-throughput fluorescent assay was developed. Our results suggested that the inhibition of the mutants was stronlgy dependent on the conformational flexibility of the inhibitors, furthermore, a critical region of the enzyme was able to fit flexibly to the ligands, independently from its mutations. Screening a library of cephalosporin derivatives, inhibitors uniqally acting in an uncompetitive manner were identified. Mutational and kinetic studies were performed on the nucleocapsid protein, which is suspected to be a substrate of the viral protease in the early phase of infection, and mutations were introduced into an infectious HIV-1 clone. There was a correlation between the protease sensitivity of mutant nucleocapsid proteins and the infectivity of the clones. The specificity of various retroviral proteinases was compared using a large set of oligopeptide substrates representing naturally occurring cleavage sites of various retroviruses: the specificity of HTLV-1 protease appeared to be fairly narrow. We have complemented our previous specificity studies performed with a substrate set representing an HIV-1 cleavage site to probe a substrate binding subsite of 11 retroviral proteases. The results obtained correlated well with the philogenetic analysis of retroviruses.

Actions (login required)

Edit Item