Hatékony búzatranszformációs módszer kidolgozása = Development of an efficient wheat transformation method

Sági, László and Tamás, László (2011) Hatékony búzatranszformációs módszer kidolgozása = Development of an efficient wheat transformation method. Project Report. OTKA.

Preview

Text 48480_ZJ1.pdf Download (3MB) | Preview

Abstract

Különböző in vitro rendszerekben kimutattuk az agrobaktérium hatékony fizikai kapcsolódását és vir indukcióját. Húsz kenyérbúza fajta növényregenerációs képességének összehasonlító elemzéséből (portokkultúra, éretlen és érett embrió, érett szkutellum) megállapítottuk, hogy a leghatékonyabb rendszer az érett embrión alapszik, de univerzálisan kiemelkedő fajtát nem találtunk. Az érett embrió agrobaktériumos transzformációjának egyes paramétereinek optimalizációjával 45% tranziens génexpressziót értünk el. Végül gyors és hatékony in planta transzformációs módszert fejlesztettünk ki búza csíranövényekre, melyet kiterjesztettünk más gabonafélékre is. Az in planta transzformációval kapott transzgénikus események gyors kimutatásának érdekében két, a pCAMBIA1391z jelzésű alapvektorból készített expressziós vektort úgy módosítottunk, hogy közös szelekciós markergénjük (hptII) búzában nem elég aktív (35S) promóterét egy erős konstitutív promóterrel (Act1) cseréltük fel (pKOL1). Ezután a riporter génekhez (intront tartalmazó gfp vagy gusA) kapcsoltunk egy másik konstitutív (Ubi1) promótert (pKOL2 illetve pKOL3), majd ezt felváltottuk egy endospermium-specifikus promóterrel (pKOL4 ill. pKOL5). Végül készítettünk két olyan vektort is, melyek vagy egy nagy molekulatömegű (HMW) glutenin alegységfehérje génjét (1Ax2*B, pKOL6), vagy pedig a ‘Porcine Epidemic Diarrhea’ vírus egy antigén fehérje génjét (pKOL7) tartalmazták egyaránt az említett endospermium-specifikus promóterhez kapcsolva. | In the early steps of fast in planta transformation we have shown that in several culture systems attachment and vir induction of agrobacteria is efficiently completed. Comparative analysis of plant regeneration capacity (anther culture, immature and mature embryo, mature scutellum) in twenty bread wheat cultivars revealed that the mature embryo system is the most efficient, but a universally excellent cultivar was not identified. By the optimization of several parameters for Agrobacterium transformation of mature embryos were optimized a transient gene expression frequency of 45% was reached. Finally, a fast in planta transformation tool was developed on the basis of wheat seedlings, which was extended to other cereals. For the quick detection of transgenic events obtained by in planta transformation two expression vectors (based on pCAMBIA1391z) were modified so that the less active 35S promoter of their selectable marker gene (nptII) was replaced by the strong constitutive Act1 promoter, resulting pKOL1. Next, a constitutive promoter (Ubi1) was fused to each of the two riporter genes (intron containing gfp or gusA, pKOL2 and pKOL3, respectively), which was then exchanged with an endosperm-specific promoter (pKOL4 and pKOL5, resp.). Finally, two more vectors were constructed for the expression of either a HMW glutenin gene (1Ax2*B, pKOL6) or an antigenic protein gene of the Porcine Epidemic Diarrhea virus (pKOL7), both genes controlled by the same endosperm-specific promoter.

Actions (login required)

Edit Item