Kálium ion-csatornák szerepének vizsgálata szívizomsejtekben a génkifejeződés RNS interferencia révén történő blokkolásával = Investigation of the role of potassium ion channels of heart muscle cells by means of RNA interference-mediated blocking of gene expression

Boldogkői, Zsolt and Acsai, Károly and Ördög, Balázs and Szuts, Viktória and Virág, László (2009) Kálium ion-csatornák szerepének vizsgálata szívizomsejtekben a génkifejeződés RNS interferencia révén történő blokkolásával = Investigation of the role of potassium ion channels of heart muscle cells by means of RNA interference-mediated blocking of gene expression. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 49171_ZJ1.pdf Download (447kB)

Abstract

Kutatási témánk a szívizom kálium ioncsatornáinak vizsgálata RNS interferencia technikával. Az RNS interferenciát kiváltó expressziós kazettát Aujeszky-féle vírus (AyV) vektorral juttattuk be a szívizomsejtekbe. A konkrét feladat megoldásához több olyan általános problémát is meg kellett oldanunk, amelyhez modellként egy másik posztmitotikus sejttípust, az idegsejteket is felhasználtuk. A munka első fázisában fluoreszcens markereket kifejező AyV törzseket állítottunk elő. E kísérletek célja a vírus génbeviteli hatékonyságának tesztelése volt. Különböző színű markereket vittünk be posztmitotikus sejtekbe (szívizom, idegsejtek). Tenyésztett felnőtt kutya szívizomsejtekben a génbeviteli hatékonyság, magas vírus titer alkalmazásával, közel 100%-os volt. Megvizsgáltuk azt is, hogy a PRV által bevitt gének működőképesek-e a célsejtekben, ill. hogy a vírus hatással van-e ezekre a sejtekre. Modellként egy fluoreszcens kalcium szenzort, a troponeont használtuk. A troponeon mind szívizomsejtekben, mind neuronokban kiválóan működött. A virulencia csökkentése végett különféle PRV mutánsokat állítottunk elő. A korai fehérje 0, a ribonukleotid reduktáz gének kiütése és az ún. antiszensz promóter inaktiválása olyan vírust eredményezett, amely epitél sejteken (PK-15 sejtvonal, ezen szaporítjuk a vírust) megfelelően szaporodott, szívizomsejtekben azonban avirulensnek bizonyult. Továbbá, kutya Kv4.3 gént csendesítő RNS interferenciát közvetítő vírusokat állítottunk elő. | Our research project is the analysis of cardiac potassium ion channels using RNA interference technique. We used pseudorabies virus (PRV) vectors for the delivery of expression cassettes evoking RNA interference. In the first phase of our work we constructed various fluorescence proteins expressing recombinant viruses. The aim of this work was to test the efficiency of gene delivery by the virus. We delivered fluorescence markers with various colors to cardiomyocytes and neurons. The efficiency of PRV-based gene delivery to canine cardiomyocytes was close to 100% in high titer virus infection. The fluorescent markers were delivered to neurons in vivo using mouse and rat models. The next step was the examination whether the delivered gene retains its functionality in a virus-based system. We have used troponeon, a genetically encoded fluorescence activity marker, as model to test this problem. According to our examinations, troponeon, delivered to both cardiomyocytes and neurons, performed very well in both cell types. We have constructed various mutant PRV strains by the deletion of early protein 0 and ribonucleotide reductase genes, as well as the deleted the putative antisense promoter region of the virus. PRVs containing these triple mutations proved to be ideal gene delivery vectors to cardiomyocytes. Furthermore, we have generated viruses expressing the hairpin RNAs for knocking down Kv4.3 gene expression of the dog cardiomyocytes.

Actions (login required)

Edit Item