Proteolízis az idegrendszerben: a humán agyi tripszin szerkezetének és funkciójának vizsgálata = Proteolysis in central nervous system: investigations of the structure and function of human brain trypsin

Szilágyi, László and Gráf, László and Juhász, Gábor and Katona, Gergely and Kékesi, Adrienna Katalin and Pálhalmi, János and Szikra, Tamás (2006) Proteolízis az idegrendszerben: a humán agyi tripszin szerkezetének és funkciójának vizsgálata = Proteolysis in central nervous system: investigations of the structure and function of human brain trypsin. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 37568_ZJ1.pdf Download (1MB)

Abstract

Klónoztunk a humán tripszinogén 4 teljes kódoló szekvenciáját. Bakterális expressziós rendszerben kifejeztük a két alternatív iniciációval keletkező izoformáját. Expresszáltuk és enzimatikusan karakterizáltuk az a tripszin 4-et. Meghatároztuk az aktív enzim benzamidin komplexének térszerkezetét. Feltérképeztük a mRNS és a fehérje eloszlását a humán agy 17 különböző régiójában. Vizsgáltuk az agyban előforduló potenciális szubsztrátjait. Megállapítottuk, hogy számos, a citoszkeletális váz felépítésében és regulálásában szereplő fehérje és a mielin bázikus fehérje szubsztrátja lehet a tripszin 4-nek. Izoláltuk a tripszinogén 4-et emberi agyszövetből és meghatároztuk amino terminális szekvenciáját. Tranziens szövettenyészetben megfelelően tervezett expressziós vektorok segítségével megállapítottuk, hogy az amino terminális leucin beépülését nem-konvencionális CTG iniciátor kodon irányítja. Meghatároztuk a tripszin - metilubellireril guanidinobenzoáttal történő reakciójának elemi sebességi állandóit. Vizsgáltuk számos természetes és szintetikus inhibitor gátló képességét, és valószínű magyarázatot adtunk arra, miért lehetetlen kanonikus mechanizmus alapján gátolni a tripszin 4-et. | We have isolated the complete coding sequence of human trypsinogen 4. In bacterial expression system we expressed and purified the two putative isoforms of the enzyme. We isolated the active enzyme as well, and characterized its enzymatic properties. We determined the X-ray structure of the trypsin 4 ? benzamidine complex. By quantitative real time PCR and sandwich ELISA we determined the determined the distribution of the mRNA and protein in 17 different regions of the human brain. By sequencing the zymogen isolated from human brain we concluded that predominant form in the human brain possesses leucine amino terminus. Using human tissue cultures transiently transfected with appropriately designed expression vectors we proved that the incorporation of the amino terminal leucine is directed by a non-conventional CTG initiation codon. We determined the elementary kinetic constants of the trypsin 4 - methylumbelliferyl guanidine benzoate reaction. We studied the inhibitory potential of several natural and synthetic polypeptides, and we reasoned why is it impossible to inhibit trypsin 4 by a canonical inhibitor.

Actions (login required)

Edit Item