Lucerna CDK inhibitor fehérje poszttraszlációs módosítása és ennek hatásai = Post-translational regulation of an alfalfa CDK inhibitor protein

Pettkó-Szandtner, Aladár (2010) Lucerna CDK inhibitor fehérje poszttraszlációs módosítása és ennek hatásai = Post-translational regulation of an alfalfa CDK inhibitor protein. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 68896_ZJ1.pdf Download (334kB)

Abstract

Megállapítottuk, hogy az MsCPK3 a KRPMt 91. szerin aminosavát foszforilálja. Kísérleteink során bebizonyosodott, hogy az A-típusú CDK-k ugyanezen az aminosavon foszforilálják a lucerna CDK inhibitor fehérjét. A B-típusú CDK foszforiláció különbözőséget vagy azonosságát technikai problémák nem tették lehetővé, lévén ezen kinázokkal nem tudtunk megfelelően erős kináz aktivitást detektálni a KRPMt foszforilációja esetén. Többszöri kísérletek ellenére sem sikerült ubiqitinálást kimutatni sem a vad típusú sem a foszforilációt mimikáló rekombináns fehérjék esetében. Elkészítettük a 91. szerin aminosav foszforilációt mimikáló glutamát valamint aszpartát mutánsait. Valamint a nem foszforilálható alanin mutánst is. Ezen rekombináns fehérjék egyike sem volt foszforilálható sem az MsCPK rekombináns fehérjével, sem az A-típusú CDK-kal. Kináz gátlási kísérleteink során a foszforilációt mimikáló szerin aszpartát csere jelentös mértékben (kétszeresére) fokozta az inhibitor fehérje gátló képességét. Elkészítettük a mutáns fehérjék növényi expressziójához szükséges vektorokat, melyekkel dohány levél korongokat transzformáltunk. A GUS pozitív kalluszok regenerációja folyamatban van, azonban sajnálatos módon a legígéretesebb, legerősebb expressziót mutató kalluszok esetében jelentős degenerációt tapasztaltunk nem képesek gyökeret létrehozni. A kutatás idő előtt lezárásra kerül, mert külföldre távoztam és a halasztási kérelmemet nem támogatta az OTKA Bizottság Elnöke. | We found that the MsCPK3 Ca-dependent protein kinase could phosphorylate the KRPMt CDK inhibitor on a serine residue at position 91. Our experiments demonstrated that the A-type CDKs phosphorylate the same amino acid residue in alfalfa CDK inhibitor proteins. We were not able to reveal the kinase activity of the B-type CDK on KRPMt due to the fact that we could not purify sufficiently strong activity for clarifying KRPMt phosphorylation event. We made 91 serine phosphorylation mimicking mutants: 91Ser-91Glu and 91Ser-91Asp, and phosphoinactive 91Ser-91Ala mutants as well. None of those recombinant proteins were phosphorylated by MsCPK3 or A-type CDKs. We could not detect ubiqitination and the subsequent degradation of either the wild-type or the phosphorylation mimicking and phosphoinactive recombinant proteins. In kinase inhibition experiments, the 91Ser-91Asp recombinant protein showed significantly (twice) increased inhibitory effect on A-type CDKs. We have created the plant expression vectors with the wild type and mutant KRPMts, which were used for tobacco leaf discs transformation. The regeneration of whole plants from GUS positive calli is in progress, but unfortunately, the most promising calli -showing the strongest expression of GUS - have significant degeneration: they can not form roots. The time before the research is completed, I left for abroad and the application for postponing the project was not supported by the president of the OTKA committee.

Actions (login required)

Edit Item