DNS (citozin-C5) metiltranszferázok szekvenciaspecifitása = Sequence-specificity of DNA (cytosine-5) methyltransferases

Kiss, Antal and Raskó, Tamás and Slaska Kiss, Krystyna (2006) DNS (citozin-C5) metiltranszferázok szekvenciaspecifitása = Sequence-specificity of DNA (cytosine-5) methyltransferases. Project Report. OTKA.

Preview

PDF 38343_ZJ1.pdf Download (121kB)

Abstract

1.) A SinI DNS-metiltranszferáz egyes mutánsai (N172S, V173L, N172S+V173L és L214S+Y229H) relaxált specifitást mutatnak, azaz a GGWCC szekvencia mellett a GGSCC szekvenciát is metilálják. Valamennyi eddig izolált, relaxált specifitást okozó mutáció az enzim feltételezett nagy doménjében található. Ez azt jelzi, hogy legalábbis a W vs. S megkülönböztetésben szerepe van a nagy domén és a kis árok közötti kölcsönhatásoknak is. Valamennyi vizsgált mutánsra jellemző a GGSCC szubsztráttal szembeni kcat érték jelentős megnövekedése. 2.) Klónoztuk két restrikciós endonukleáz (BspRI,GGCC; BepI, CGCG) génjét. A DNS szekvencia alapján a BspRI 317, a BepI 348 aminosavból áll. A gének átalakításával és expressziós vektorba ültetésével túltermelő klónokat hoztunk létre. 3.) Az SssI metiltranszferáz különböző variánsait állítottuk elő abból a célból, hogy terminálisan kovalens kötéssel oligonukleotidhoz kapcsolható legyen. A nemzetközi együttműködésben végzett munka célja egy ?programozható? specifitású DNS metiltranszferáz kialakítása, melynek szelektivitását a kapcsolt oligonukleotid határozza meg. | 1.) Some mutants of the SinI DNA methyltransferase (N172S, V173L, N172S+V173L and L214S+Y229H) display relaxed sequence specificity, i.e. methylate in addition to the GGWCC cognate sequence also the GGSCC sequence. All mutations so far isolated and resulting in relaxed specificity are located in the assumed large domain of the enzyme. This finding indicates that, at least in the discrimination between W and S, interactions between the large domain and the minor groove play a role. All mutants investigated are characterized by a large increase in the kcat values toward the GGSCC substrate. 2.) The genes of two restriction endonucleases (BspRI,GGCC; BepI, CGCG) have been cloned. Deduced from the DNA sequence, the BspRI endonuclease consists of 317 and the BepI of 348 amino acids. Over-expressing clones have been constructed by modifying the genes and cloning them into expression vectors. 3.) Different variants of the SssI methyltransferase were constructed with the aim to link the enzyme by terminal covalent coupling to oligonucleotides. The goal of the project done in international cooperation is to create a ?programmable? DNA methyltransferase whose selectivity is determined by the coupled ologonucleotide.

Actions (login required)

Edit Item